70PM008｜第70回臨床検査技師国家試験過去問

PCR 法で正しいのはどれか。

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正解: 5

正答

PCRのプライマー設計とアニーリング温度が、特異性・増幅効率に及ぼす影響を理解します。

PCRでは、変性、アニーリング、伸長を反復して標的DNAを増幅します。アニーリング温度はプライマーのTm値より数℃低く設定するのが基本です。高すぎるとプライマーが結合しにくくなり増幅量が減り、低すぎると非特異的結合が増えます。

プライマーは一般に18〜25塩基程度、GC含有量40〜60％程度とし、相補的配列やヘアピン形成を避けます。反応液中の最終プライマー濃度は通常サブμM程度で、10 μM以上という高濃度は非特異的増幅やプライマーダイマーの原因になります。

ひっかけポイント
増幅しないときにアニーリング温度を上げると、結合はさらに難しくなります。

1．Tm 値が低いと特異性が高くなる。
誤り。
Tm値が低いこと自体で特異性が高くなるわけではありません。低温でのアニーリングは非特異的結合を増やしやすくなります。

2．プライマー濃度は 10 μM 以上にする。
誤り。
プライマーの最終濃度は通常0.1〜1 μM程度で調整します。10 μM以上は一般的な設定として高すぎます。

3．増幅しにくい場合にはアニーリング温度を上げる。
誤り。
増幅しにくい場合、アニーリング温度を適度に下げると結合しやすくなります。上げると増幅効率が低下します。

4．プライマーの塩基配列は GC 含有量を 20％前後にする。
誤り。
GC含有量は一般に40〜60％程度が目安です。20％前後ではTmが低くなり、安定した結合が得にくくなります。

5．アニーリング温度はプライマーの Tm 値以下に設定する。
正しい。
アニーリング温度はプライマーのTm値よりやや低く設定するため、正しい記述です。