68PM010｜第68回 臨床検査技師国家試験 過去問

正答

2（プライマー濃度を下げる）

この問題のポイント

PCRで標的以外への誤ったプライマー結合を減らす条件と、非特異的増幅を増やす条件を見分ける問題です。

解説

ポリメラーゼ連鎖反応〈PCR〉は、二本鎖DNAの変性、プライマーのアニーリング、DNAポリメラーゼによる伸長を繰り返して標的領域を増幅します。増幅産物の特異性は、二本のプライマーが目的配列にだけ十分強く結合するかで大きく決まります。プライマーが過剰だと、部分的に似た非標的配列への結合やプライマー同士の結合によるプライマーダイマーが起こりやすいため、適切な範囲で濃度を下げると特異性が高まります。ただし下げすぎれば目的産物の収量も低下するので最適化が必要です。アニーリング温度を下げる、高濃度のマグネシウムイオンを加える、酵素やサイクル数を過剰にする操作は、反応量を増やしてもミスマッチを許容し、背景産物まで増幅しやすくなります。特異性向上には適切に高いアニーリング温度、プライマー設計、hot-start法なども有効です。

選択肢の確認

1．誤り。サイクル数を増やすと目的産物だけでなく微量に生じた非特異的産物も増幅され、終盤の背景が増えやすくなります。
2．正しい。プライマー濃度を適切に下げると非標的配列への結合やプライマーダイマーを抑え、増幅産物の特異性を高められます。
3．誤り。アニーリング温度を下げると塩基のミスマッチがあってもプライマーが結合しやすくなり、特異性は低下します。
4．誤り。マグネシウムイオンはポリメラーゼ反応に必要ですが、高すぎるとDNA二本鎖を安定化して誤った結合も許容し、非特異的増幅を増やします。
5．誤り。DNAポリメラーゼを過剰にすると誤ってアニーリングしたプライマーからも伸長が進みやすく、特異性向上にはつながりません。

覚えるポイント

• プライマー濃度は低すぎても高すぎても不適切で、最適化が必要です。
• アニーリング温度を上げると結合の厳密さが増します。
• Mg2+・酵素・サイクル数の過剰は非特異的産物を増やし得ます。